攻堅新冠之利刃：BioTek的微孔板設備助力搭建新冠病毒蛋白酶抑制劑高通量篩選平臺

與“新冠”的持久戰

2020年初的新冠全球疫情爆發(fā)之際，Agilent BioTek在第一時(shí)間整理出了微孔板檢測設備在抗擊新冠病毒的研究中可以參與的實(shí)驗項目，并且后續推出了較為全面的抗病毒藥物開(kāi)發(fā)解決方案。

上圖：Agilent產(chǎn)品在抗病毒藥物開(kāi)發(fā)體外實(shí)驗解決方案

至今為止，并且這場(chǎng)席卷全球的流行病從各個(gè)方面改變了我們的生活和工作方式，雖然這種單鏈RNA病毒仍然未被徹底消滅，但是全球相關(guān)崗位上的科學(xué)家及工作人員們已經(jīng)積累了大量的科研成果，涉及基礎研究、疫苗，抗體，抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)的各領(lǐng)域，其中不乏Agilent相關(guān)設備的使用。

近期小編將挑選其中使用頻率較高的實(shí)驗和大家進(jìn)行分享，希望能夠幫助開(kāi)展相關(guān)檢測項目的老師更高效的使用現有的設備。

上圖：截至目前為止，Cytation系列產(chǎn)品在新冠病毒相關(guān)領(lǐng)域已發(fā)表170篇以上的出版物，其中不乏影響力頗高的頂級雜志。

第一彈：來(lái)自中國團隊的國際首創(chuàng )——成功開(kāi)發(fā)基于FP技術(shù)的新冠病毒抑制劑高通量篩選平臺

近期，來(lái)自國內皖南醫學(xué)院陳云雨副教授團隊聯(lián)合中國醫學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫學(xué)院醫藥生物技術(shù)研究所司書(shū)毅教授團隊報道了一種新型基于熒光偏振（FP，fluorescence polarization）技術(shù)和生物素-親和素反應（biotin-avidin system）原理的Mpro小分子抑制劑高通量篩選方法，研究成果發(fā)表在Cell & Bioscience雜志，這是國際首次將FP技術(shù)應用于靶向Mpro的抑制劑篩選中。

新冠病毒屬于單鏈RNA病毒，其本身變異性高，目前針對新冠病毒肺炎疫情的各項策略齊頭并進(jìn)，除了各類(lèi)疫苗及中和抗體類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，針對靶向病毒及宿主特異性靶點(diǎn)的藥物也是各大研究機構及相關(guān)企業(yè)攻堅的方向。

目前在研的開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)包括靶向病毒于宿主細胞膜融合環(huán)節、抑制病毒在細胞內的翻譯轉錄復制環(huán)節及成熟病毒顆粒的釋放三大病毒生命周期的各項環(huán)節，其中新型冠狀病毒主蛋白酶Mpro（也被稱(chēng)為3C-like protease, 3CLpro），由于其主要參與病毒在細胞內的翻譯轉錄復制，進(jìn)化保守，且人體內沒(méi)有同源蛋白，因此Mpro主蛋白酶是一個(gè)抗病毒藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)。

上圖：SARS-CoV-2的Mpro的蛋白質(zhì)結構，圖片來(lái)源于中國科學(xué)院上海生命研究所。

目前針對Mpro蛋白酶靶點(diǎn)的體外高通量篩選技術(shù)包括聯(lián)合計算機虛擬篩選、熒光共振能量轉移（FRET）法、熒光素酶報告基因篩選法、FlipGFP生物傳感器活細胞篩選法等，但這些方法在早期藥物開(kāi)發(fā)中，時(shí)間成本及經(jīng)濟成本等均有待提升。陳云雨和司書(shū)毅研究團隊開(kāi)發(fā)的基于FP技術(shù)的篩選模型恰好彌補了這些短板。

熒光偏振小劇場(chǎng)

先來(lái)簡(jiǎn)介一下熒光偏振技術(shù)（熒光的基本原理和偏振光的基本原理如果有不懂的童鞋請自行百度啦，或者后臺騷擾小編也可以）。

Perrin于1926年首先描述了熒光偏振的理論，他發(fā)現當溶液中的熒光分子受到偏振光激發(fā)時(shí)，如果分子保持靜止，該分子將發(fā)出固定偏振平面的發(fā)射光（就是這個(gè)發(fā)射光仍保持偏振性）。然而如果分子旋轉或翻轉，那么發(fā)射光的偏振平面將不同于初始激發(fā)光的偏振平面（偏振性下降）。

影響這一過(guò)程的主要因素是分子的旋轉弛豫時(shí)間，也就是分子動(dòng)的越快，偏振性下降越大。而分子旋轉弛豫時(shí)間在液體粘度、絕對溫度相同的條件下，又主要受到分子體積的影響，所以如果分子量大，同樣強度偏振光激發(fā)后，檢測到的發(fā)射偏振光偏振性高，相反，如果分子量小，檢測到的發(fā)射光偏振性降低。

因此，以熒光偏振基礎發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)領(lǐng)域中分子之間的相互作用或特定分子檢測，它最大的特點(diǎn)是可以實(shí)時(shí)跟蹤檢測分子間結合/分離的變化，解決了困擾熒光技術(shù)使用者們對于熒光無(wú)法定量的煩惱，并且相對于其他熒光分子互作技術(shù)，FP成本低、靈敏度高，可開(kāi)發(fā)均相體系，非常適合用于開(kāi)展分子檢測及高通量藥物篩選。

熒光偏振技術(shù)如何應用于Mpro抑制劑的篩選？

雖然熒光偏振技術(shù)已經(jīng)較為廣泛的應用于臨床免疫檢測、人畜共患病檢測以及基礎科研的分子相互作用檢測，但是在抗新冠病毒藥物篩選領(lǐng)域中，特別是基于Mpro蛋白酶抑制劑的篩選中尚未開(kāi)發(fā)出成熟體系。

陳云雨和司書(shū)毅研究團隊通過(guò)巧妙地設計，構建熒光探針FITC-S-Biotin（FITC-AVLQSGFRKK-Biotin，下圖紫紅色虛線(xiàn)）作為FP示蹤劑Tacer，該Tracer具有三明治樣結構：中間包含了Mrpo蛋白酶（下圖的剪刀）的酶切位點(diǎn)，一端偶聯(lián)了FITC熒光探針（下圖綠色原型），另一端是Biotin，可以與蛋白Avidin（下圖紅色新月形）特異性結合，形成分子量較大的結構。

當存在活性抑制劑（下圖藍色六邊形）阻斷Mpro酶切功能時(shí)，未被Mpro切割的Tracer具有較大的熒光偏振值；當存在Mpro蛋白酶及非活性抑制劑（下圖棕色六邊形），tracer被切斷，FITC端釋放成為小分子，熒光偏振值下降。利用該體系，可篩選具有抑制Mpro酶活性的化合物。

上圖：三明治樣FP Tracer篩選原理示意圖

經(jīng)過(guò)多項優(yōu)化實(shí)驗后，研究團隊驗證了該FP篩選體系的適用性和質(zhì)量穩定性，我們知道， Z 因子是高通量篩選（HTS）實(shí)驗評估和驗證中使用最廣泛的參數，基于此FP為基礎的篩選體系的Z因子可以達到0.85。

上圖：基于FP篩選模型的質(zhì)量驗證

研究團隊應用本篩選模型對天然產(chǎn)物化合物庫進(jìn)行高通量篩選，成功篩選到新型的競爭性抑制劑二鵝掌菜酚（Dieckol），它是一種從Ecklonia cava提取的天然多酚類(lèi)化合物，具有良好的Mpro抑制活性，在無(wú)DTT存在條件下，其IC50值為2.9±0.2 μM。表面等離子共振實(shí)驗（SPR）結果表明，Dieckol與Mpro具有較高的親和力，KD值為0.22 μM。后續的分子對接模型結果表明，二鵝掌菜酚能與Mpro活性中心形成牢固的氫鍵，證實(shí)了其競爭性結合模式。

上圖：天然產(chǎn)物庫初篩結果，篩選到有效化合物Dieckol

該基于FP的篩選模型有哪些優(yōu)勢？

該研究的主要開(kāi)發(fā)者之一的陳云雨老師評價(jià)，與常規的FRET篩選方法相比，在本熒光偏振篩選模型中，底物的單孔使用量?jì)H為20 nM，為FRET篩選模型中底物單孔使用量的1/500；并且該方法操作簡(jiǎn)便，每輪篩選時(shí)間僅為1 h，具有極高的穩定性、靈敏性和經(jīng)濟性，用一句話(huà)來(lái)說(shuō)，就是“快，省，準”！。

最后，什么樣的設備能夠更好的支持該FP篩選模型？

文章中所有的微孔板實(shí)驗，包括FP和FRET動(dòng)力學(xué)檢測采用的是BioTek的Cytation5多功能微孔板檢測系統，這套設備最大的優(yōu)勢是采用的全球專(zhuān)利技術(shù)Hybrid技術(shù)，其靈活的四光柵模塊，支持各類(lèi)基于的FRET酶底物切割動(dòng)力學(xué)檢測篩選，而其高靈敏性能的濾光片模塊，則為此文中重點(diǎn)的熒光偏振實(shí)驗提供了穩定可靠的數據輸出保障。

該研究負責的老師評價(jià)：“Agilent BioTek的儀器很好用，文中的大部分數據都依靠該設備獲得”。

此外，Cytation可友好對接自動(dòng)化設備，比如BioStack或者Agilent的BenchCel，可以實(shí)現多塊微孔板的自動(dòng)讀板及液體處理步驟。

上圖：Cytation& EL406洗板機與BenchCel的自動(dòng)化對接